蛋白质印迹法实验步骤
蛋白质印迹法就是将膜与 5% w/v 脱脂奶粉、1X TBS 以及 0.1% Tween 20 中的稀释的一抗在 4°C 下进行夜间孵育，同时轻轻晃动。
注意：请参阅一抗产品网页了解推荐的抗体稀释度。
A. 溶液与试剂
注：使用反渗透去离子水 (RODI) 或同等级别的水配制溶液。
- 20X 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS)：(#9808) 若要制备 1 L 1X PBS：将 50 ml 20X PBS 添加至 950 ml dH2O，混合。
- 10 X Tris 缓冲盐水 (TBS)：(#12498) 若要配制 1 L 1X TBS：将 100 ml 10X 添加至 900 ml dH2O ，混合。
- 1X SDS 样品缓冲液：Blue Loading Pack (#7722) 或 Red Loading Pack (#7723) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加至 1 体积的 3X SDS 样品缓冲液，配制新鲜的 3X 还原性上样缓冲液。用 dH2O 稀释至 1X。
- 10X Tris-Glycine SDS 电泳缓冲液：(#4050) 若要配制 1 L 1X 电泳缓冲液： 将100 ml 10X 电泳缓冲液添加至 900 ml dH2O ，混合。
- 10X Tris-Glycine 转移缓冲液：(#12539) 要制备 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加至 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中，并混合。
- 含有 Tween 20 (TBST) 的 10 X Tris 盐缓冲液：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST： 将 100 ml 10X TBST 添加至 900 ml dH2O 中并混合。
- 脱脂奶粉：(#9999)。
- 封闭缓冲液：含 5% w/v 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加至 150 ml 1X TBST 中并充分混匀。
- 洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。
- 一抗稀释缓冲液：含 5% 脱脂奶粉的 1X TBST；要制备 20 ml，将 1.0 g 脱脂奶粉添加至 20 ml 1X TBST 中并充分混匀。
- Biotinylated Protein Ladder Detection Pack：(#7727)。
- Blue Prestained Protein Marker, Broad Range (11-250 kDa)： (#59329)。
- 印迹膜：(#12369) 本实验步骤针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常推荐 0.2 m 孔径。
- HRP 偶联二抗：Anti-rat IgG, HRP-linked Antibody (#7077)。
- 检测试剂：SignalFire ECL Reagent (#6883)。
B. 蛋白质印迹
制备样品的常规流程。
- 添加
粤公网安备 44031102000815号
